Salah satu potensi besar yang ada di lautan dan masih dalam tahap eksplorasi adalah spons. Eksplorasi yang dilakukan bukan hanya terkait dengan spons itu sendiri melainkan juga pada simbion mikoorganisme pengikutnya. Mikrooganisme tersebut dipercaya sebagai penghasil senyawa bioaktif. Beberapa diantaranya memiliki kemampuan proteolitik atau kemampuan mendegradasi protein. Penelitian sebelumnya telah berhasil mengisolasi bakteri simbion spons beraktivitas proteolitik. Namun, pengembangan aplikasi sebagai biodegradasi protein dari isolat tersebut mengalami kendala berupa belum diketahui sumber C dan N yang tepat sebagai nutrisi produksi biomassa sel. Tujuan penelitian ini adalah mencari dan melakukan optimalisasi pengkayaan media berdasarkan sumber C dan N untuk produksi biomassa sel isolat proteolitik terbaik. Penelitian ini menggunakan metode eksperimental laboratoris dengan beberapa tahap yaitu: 1. Uji konfirmasi aktivitas proteolitik, 2. Pemilihan sumber C dan N, 3. Optimalisasi sumber C dan N, 4. Kinetika pertumbuhan dengan kombinasi pengkayaan media pada isolat proteolitik terbaik. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat 3 isolat terbaik yaitu isolat TA.8, TA.14 dan TA.15. Perlakuan optimalisasi sumber C terbaik untuk ketiga isolat adalah glukosa dengan konsentrasi 2,5% untuk TA.8, 1,5% untuk TA.14 dan TA.15. Sedangkan, optimalisasi sumber N terbaik adalah Amonium nitrat 0,15%.